Il Museo dell'Opera è collocato nella parte più monumentale del complesso di Santa Croce che si sviluppa intorno ai due chiostri attigui alla Basilica; allestito come museo già dal 2 novembre del 1900, sotto la direzione di Guido Carocci, dove già esisteva un deposito di opere d'arte, in parte provenienti dalle demolizioni del centro storico del periodo del Risanamento (frammenti architettonici che oggi si trovano nel lapidario del Museo nazionale di San Marco).

Raccoglie opere di scuola fiorentina di primaria importanza, come il grande Crocifisso di Cimabue, qui ricollocato, nel Refettorio trecentesco, dopo esser stato gravemente danneggiato dall'alluvione che nel 1966 travolse Firenze.

E' possibile ammirare gli affreschi staccati di Taddeo Gaddi e dell'Orcagna, una serie di terrecotte invetriate dei Della Robbia, la grande scultura in bronzo dorato raffigurante San Lodovico di Tolosa di Donatello, oltre a dipinti, sinopie, rilievi e arredi lignei.