Il complesso degli Innocenti, oltre a un ricco Archivio storico, custodisce anche la Pinacoteca dello Spedale, allestita nel salone soprastante il loggiato brunelleschiano. La collezione è piccola ma vanta alcune opere di grandissimo pregio. Fra queste lo stendardo processionale dello Spedale raffigurante la Madonna con i piccoli Innocenti, con il loggiato brunelleschiano sullo sfondo, eseguito nel 1445 da Domenico di Michelino e poi restaurato agli inizi del Cinquecento dalla bottega di Francesco Granacci.
Proveniente dall'altar maggiore della chiesa dello Spedale è la grande pala raffigurante l'Adorazione dei Magi, uno dei capolavori di Domenico Ghirlandaio su tavola, dipinta dal 1485 al 1488 in collaborazione con Bartolomeo di Giovanni, autore dei sette pannelli della predella. Nella grande pala, curata nei minimi dettagli, figurano i Magi riccamente vestiti che presentano due bambini feriti alla Madonna, chiaro riferimento agli scopi assistenziali dello Spedale. Sullo sfondo infatti è rappresentata la strage degli innocenti, accanto ad un magnifico paesaggio con una città portuale che testimonia lo studio da parte del Ghirlandaio delle opere di scuola fiamminga. A sinistra è raffigurato san Giovanni Battista in ginocchio davanti a un giovane Magio vestito di giallo che offre una coppa; alle spalle di quest'ultimo il pittore avrebbe raffigurato se stesso accanto al committente dell'opera, il responsabile dell'Istituto, vestito di nero. Sulla destra compaiono riccamente vestiti i membri dell'Arte della Seta, patroni dello Spedale, mentre dietro alla Madonna sono raffigurati due personaggi simbolo dell'impegno di laici e religiosi nella opera assistenziale. Chiudono in alto un coro di angeli in atto di cantare il Gloria, del quale sorreggono entro un cartiglio la partitura musicale, e un arco rinascimentale che riporta la data di completamento dell'opera.
Bellissima è anche la brillante terracotta invetriata raffigurante la Madonna col Bambino, eseguita da Luca della Robbia nel 1448, di uno smagliante bianco, colorato solo negli occhi e nel basamento di blu. Di notevole interesse la Madonna col Bambino, angeli e santi di Piero di Cosimo (1490 circa) e la Madonna col Bambino e un angelo di Sandro Botticelli, opera giovanile ispirata a un'analoga Madonna di Filippino Lippi agli Uffizi.
