La chiesa, Edificata in memoria della vittoriosa battaglia di Campaldino contro gli aretini, combattuta l'11 giugno 1289, giorno di san Barnaba, ha una facciata a capanna con portale a sesto acuto, ornato da tre stemmi: quello del Comune sulla sinistra (giglio), quello del Popolo di Firenze al centro (croce rossa su sfondo bianco) e lo stemma di Parte Guelfa sulla destra (aquila che artiglia il drago). Per l'Arte dei Medici e Speziali fu eseguita la robbiana Madonna col Bambino, in terracotta policroma invetriata (1528-30). Lungo la parete di destra della chiesa sono visibili i profili delle slanciate monofore ad arco trecentesche, mentre al di sopra dell'abside si eleva il campanile a vela a tre fornici.

All'interno, la chiesa presenta una struttura a navata unica introdotta da un ambiente più basso suddiviso in tre navatelle da colonne tuscaniche, sul quale originariamente trovava luogo il coro delle monache (la cui parete divisoria venne demolita nel 1865 e sostituita con l'attuale parapetto); la navata presenta un soffitto ligneo riccamente intagliato e dorato, opera di Giovanni Vernaccini (1717), al di sopra del quale (non visibili dal basso) vi sono le antiche capriate lignee trecentesche che presentano ancora brani dell'originaria decorazione pittorica policroma.

Tutti i quadri presenti all'interno della chiesa provengono da altri edifici di culto e pervennero in San Barnaba in seguito alle soppressioni napoleoniche: fra di essi una cinquecentesca Madonna col Bambino e i santi Benedetto e Bernardo di Pier Francesco Foschi, un'Annunciazione attribuita a Pompeo Caccini, una Flagellazione di Giovanni Maria Butteri (databile all'ultimo decennio del XVI secolo), una Deposizione di Bernardino Poccetti (1596). La navata termina con l'abside quadrangolare, coperta con volta a crociera riccamente ornata con stucchi di Alessandro e Gaetano Gori, al centro della cui parete di fondo vi è un'Assunzione tra apostoli e santi di Fabrizio Boschi (1597), proveniente dalla chiesa del monastero di Santa Lucia a Camporeggi.

Fanno parte del corredo pittorico i resti di un affresco dell'ultimo quarto del XIV secolo con San Clemente (attribuito a Cenni di Francesco di ser Cenni), San Michele Arcangelo (attribuito a Lorenzo di Bicci) e la scena di un battesimo; inoltre, a lato del secondo altare di destra, è murato un tabernacolo per gli oli santi riconducibile alla bottega di Benedetto da Maiano.