Il Cenacolo è il refettorio di un grande monastero di monache camaldolesi. Rinnovato nel XV secolo, l’ambiente colpisce per la sua solennità. Nella parete di fondo stanno i grandiosi affreschi di Andrea del Castagno, dipinti verso il 1445. Queste opere dimostrano grande forza espressiva, contrastato senso del colore e attenta struttura prospettica e rappresentano l'Ultima Cena, la Crocifissione, la Deposizione e la Resurrezione.

Nel Museo del cenacolo di Sant'Apollonia sono conservate anche altre opere quattrocentesche provenienti dall'ex monastero e dall'ospedale di Santa Maria Nuova, di Paolo Schiavo di Neri di Bicci (due tavole) e le poche tracce degli affreschi e delle sinopie di Domenico Veneziano, con l'aiuto di Alesso Baldovinetti, Piero della Francesca e lo stesso Andrea del Castagno, con le Storie della Vergine, già nella chiesa di Sant'Egidio.

Tra le opere di altri autori sono presenti una Pietà e una Crocifissione con sinopia di Paolo Schiavo (dal monastero), una Madonna col Bambino e santi (dalla chiesa del monastero) e un'Incoronazione della Vergine e santi di Neri di Bicci, un tabernacolo di scuola fiorentina del 1470 circa.