La chiesa fu la prima basilica dove vennero usati elementi dell'architettura gotica a Firenze, in particolare i caratteri tipici dell'architettura gotica cistercense. L'interpretazione del nuovo stile fu molto originale e fece da esempio ad un gran numero di edifici religiosi successivi. È lunga 99,20 metri, larga 28,20, mentre il transetto misura al massimo 61,54 m. Presenta una pianta a croce commissa (cioè a T), suddivisa in tre navate con sei ampie campate che si rimpiccioliscono verso l'altare (11,50 m verso l'altare contro i 15 verso la facciata), dando la sensazione di una lunghezza maggiore di quella reale. La copertura è affidata alle volte a crociera a costoloni con archi a sesto acuto, decorati da pitture parietali bicrome bianco-verdi, sostenute da pilastri polistili, cioè a sezione mista. L'ampiezza della navata centrale e la sua altezza al limite delle possibilità statiche per un edificio del genere fanno sì che le navate laterali sembrino ariosamente fuse in un'unica amplissima aula.

Su commissione della famiglia Rucellai, Leon Battista Alberti disegnò il grande portale centrale, la trabeazione e il completamento superiore della facciata, in marmo bianco e verde scuro di Prato (serpentino), terminata nel 1470. Dopo il Concilio di Trento, tra il 1565 e il 1571 la chiesa fu rimaneggiata ad opera di Giorgio Vasari, con la rimozione del recinto del coro e la ricostruzione degli altari laterali, che comportò l'accorciamento delle finestre gotiche. Tra il 1575 e il 1577 fu costruita da Giovanni Antonio Dosio la cappella Gaddi. Un ulteriore rimaneggiamento si ebbe tra il 1858 e il 1860 ad opera dell'architetto Enrico Romoli.

In fondo alla navata principale, ad un'altezza di 45 metri, è stato ricollocato dal 2001 il Crocifisso di Giotto (databile verso il 1290), dopo dodici anni di restauro, nella posizione dove verosimilmente doveva trovarsi fino al 1421.

Numerose e di altissimo profilo sono le opere d'arte, fra le quali spicca la Trinità di Masaccio, opera sperimentale sull'uso della prospettiva, a proposito della quale il Vasari ebbe a dire: "Pare che sia bucato quel muro". Rappresenta uno dei più importanti capolavori dell'arte rinascimentale, attuazione dei nuovi canoni stilistici in pittura, al pari dei traguardi architettonici di Brunelleschi e scultorei di Donatello.

Annessi alla chiesa si trovano gli edifici del convento, con tre chiostri monumentali. Chiostro Verde, Cappellone degli Spagnoli e refettorio oggi fanno parte del Museo di Santa Maria Novella. Nella cappella interna del convento, si trova l'interessante tavola delle Effigie domenicane, opera di un maestro anonimo della prima metà del XIV secolo.