Il percorso espositivo si sviluppa sui tre piani dell'edificio e comprende quattro distinte sezioni. La sezione medievale, nell'ala meridionale del Palazzo, ospita sculture ed affreschi dalla fine del VI al XIV secolo. Tra esse si segnalano gli affreschi gotici provenienti dal Convento benedettino di S. Margherita di Como; la collezione di scultura altomedievale e romanica e importanti rilievi un tempo caoticamente murati alle pareti dello scalone di Palazzo Giovio.
La Quadreria, situata al piano nobile del Palazzo, offre una panoramica dei maggiori artisti attivi a Como dall'età controriformata al XIX secolo. Sono conservate due grandi lunette provenienti dalla Chiesa domenicana di S. Giovanni Pedemonte, demolita nel 1810: la Caduta degli angeli ribelli di Pier Francesco Mazzucchelli detto il Morazzone (1573-1626) e il Trionfo dell'arcangelo Michele di Carlo Francesco Nuvolone (1608-1662); opere di Cristoforo Caresana (1601 ca.-1629), Giovanni Paolo Ghianda (1597 ca., 1637), dei fratelli Recchi e tre dipinti di Giovan Pietro Gnocchi (1553 ca.-1609).
Vi sono poi due sezioni dedicate al "ritratto" e alla "pittura di genere" in cui sono conservati lo splendido Ritratto di Vespasiano Gonzaga all'età di ventotto anni (1559), tradizionalmente attribuito al fiammingo Antonio Moro; due Vasi con composizioni floreali di Mario Nuzzi (1603-1673) e le imponenti Battaglie di Antonio Calza (1653-1725).
Il Settecento mostra il perdurare del legame con Roma attraverso le prestigiose opere di Giovan Paolo Panini (1691/92-1765) Consacrazione del Cardinale Giuseppe Pozzobonelli nella Basilica dei SS. Ambrogio e Carlo al Corso e di Pompeo Batoni (1708-1787) autore del bellissimo dipinto Vulcano. Sono esposti anche un Ritratto di gentildonna di Alessandro Magnasco (1667-1749) e l'Angelo custode di Pietro Ligari (1686-1752). Conclude il percorso la sala dedicata alla "pittura dell'Ottocento", in cui si documenta il genere del ritratto e del paesaggio.
La sezione del Novecento, introdotta dai pannelli fotoceramici di Marcello Nizzoli, documenta, attraverso immagini fotografiche, dipinti, sculture e prototipi d'arredo, i momenti salienti della creatività artistica nel corso del XX secolo a Como, dal Futurismo di Antonio Sant'Elia al Razionalismo di Giuseppe Terragni, all'Astrattismo del Gruppo Como composto da Mario Radice, Manlio Rho, Carla Badiali e Aldo Galli. Inoltre la sezione del Novecento documenta anche il fenomeno dell'Integrazione delle Arti, tentato precocemente a Como tra architettura, scultura e pittura.
