La basilica di San Petronio è la chiesa principale di Bologna: domina l'antistante piazza Maggiore e, nonostante sia ampiamente incompiuta, è la sesta chiesa più grande d'Europa, dopo San Pietro in Vaticano, Saint Paul a Londra, la cattedrale di Siviglia, il Duomo di Milano e il Duomo di Firenze. Le sue imponenti dimensioni (132 metri di lunghezza e 60 di larghezza, con un'altezza della volta di 44,27 metri, mentre sulla facciata tocca i 51 metri) ne fanno la quarta chiesa più grande d'Italia (la terza, se si esclude San Pietro, che dal 1929 fa parte del territorio dello Stato della Città del Vaticano). Con il suo volume di 258.000 m³, la basilica è la chiesa gotica costruita di mattoni più grande del mondo.

L'interno della basilica presenta sei grandiose campate a pianta quadrata di circa 19 metri di lato della navata centrale, alle quali corrispondono altrettante campate laterali divise in due parti: sei mezze campate a pianta rettangolare corrispondenti alle navatelle su cui, per ciascuna, si aprono una coppia di cappelle. La sesta campata della navata centrale è occupata dal presbiterio, che esorbita fino a metà della quinta campata con l'ampio ciborio del Vignola. La suddivisione in navate è realizzata tramite enormi pilastri in mattoni sagramati, con basi elaborate e capitelli a foglie in arenaria. Lo spazio alla fine delle campate è violentemente interrotto da un muro di testata che blocca il "naturale" svolgimento dello spazio interno, dimostrando palesemente l'incompiutezza dell'edificio, mentre la navata centrale si conclude in un'abside, priva però di vetrate verticali tipiche dello stile gotico. La particolarità dell'edificio sta nel fatto di non essere orientato in maniera tradizionale con l'abside a est e la facciata ad ovest, bensì rispettivamente a sud e a nord. Questo ha fatto in modo che le fiancate, essendo loro rivolte a est e ovest, venissero penetrate dalla luce solare durante tutto l'arco della giornata, inondando con una luce particolarmente diffusa tutto l'interno, senza esaltare i contrasti.

La Cappella dei Re Magi è l'unica che conserva, quasi intatta, la decorazione originaria. La cancellata gotica in marmo fu disegnata da Antonio di Vincenzo (1400). Furono dipinti da Jacopo di Paolo il "Polittico ligneo" e le finestre policrome. Le pareti furono sontuosamente affrescate da Giovanni da Modena con un ciclo raffigurante: "Il Paradiso" e "l'Inferno" a sinistra, nella parete di destra "Le storie dei Re Magi", nella parete di fondo "Consacrazione di San Petronio" e scene della sua vita.

In controfacciata è un monumento sepolcrale in cotto eseguito da Zaccaria Zacchi (1526). Sui robusti pilastri alcuni pannelli ad affresco con Santi della prima decorazione pittorica del tempio (prima metà del secolo XV).